Интенсивность реакции ГЗ Т в процентах рассчитывали по формуле: ГЗТ(%) = [(Е - К') /(К * - К -) | х 100%, где Е, К+ и К' отек лапки у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля, соответственно.

На рисунке 20 представлена зависимость изменения интенсивности реакции ГЗТ от дозы предоблучения раствора МЦ540. Видно, что введение мышам необлученного раствора МЦ540 (время облучения ч) не приводило к изменению уровня реакции ГЗТ по сравнению с положительным контролем (К+). Предоблучение в течение 1 часа раствора МЦ540 приводило к увеличению на 49%> интенсивности реакции ГЗТ у мышей (р

Таким образом, на модели реакции ГЗТ было показано, что облучение раствора МЦ540 приводит к образованию фотопродуктов, способных влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. При этом при малых дозах облучения МЦ540 образуются фотопродукты, обладающие активирующим действием на

ГЗТ. Напротив, при больших дозах предоблучения - фотопродукты с супрессорным действием на ГЗТ..

к-

время облучения (ч)

Рис. 20. Модуляция реакции предоблученного МЦ540.

ГЗТ к ЭБ под действием

Раствор МЦ540 (17 мкМ в ФБР, содержащем 10% этанола) облучали различными дозами видимого света зеленого диапазона (1 = 23,6 Вт/м2, длина волны X = 546 нм). Мышам вводили внутривенно 0,5 мл предоблученного разными дозами раствора МЦ540 за 24 часа до повторного введения ЭБ в лапку. К+ (положительный контроль) и К' (отрицательный контроль) -сенсибилизированные ЭБ и интактные мыши, получившие по 0,5 мл ФБР с 10% этанола, соответственно.

Каждая точка на кривой - среднее для 8 мышей ± SEM *р

Такой двухфазный характер действия фотопродуктов МЦ540 на ГЗТ, а именно: ее активацию и супрессию - можно объяснить тем, что при фотоокислении МЦ540 образуется несколько видов фотопродуктов [Pervaiz S. et al. 1999; Pervaiz S. et al., 1998]. Один из этих фотопродуктов (С5) -промежуточнй, а два других (меродантоин и С2) - вторичные продукты фотодеградации С5 (рис.2 Б раздела "Обзор литературы"). С учетом этих

данных можно предположить, что на начальном этапе накапливались фотопродукты С5, а затем меродантоин и С2, которые взаимодействовали с различными биологическими мишенями (например, с разными типами иммунокомпетентных клеток, отвечающих за развитие или супрессию КЧ).

Обнаруженный в данной работе эффект модуляции реакции ГЗТ продуктами фотодеградации мероцианина-540 качественно совпал с таковым, для фотопродуктов псоралена [Potapenko A.Ya. et al., 1994; Kyagova A.A. et al., 1996].

В этой связи можно предположить, что несмотря на значительные различия в химической структуре МЦ540 и псоралена, во-первых, фотопродукты данных красителей могут иметь сходные химические группы, ответственные за иммуномодуляцию, во-вторых, сходство эффектов пМЦ540 и облученного псоралена на ГЗТ может быть обусловлено близкими иммунными механизмами их модулирующего действия.

На втором этапе было оценено влияние предоблученного МЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели КЧ к ДНФБ у мышей. Инициацию реакции к ДНФБ у мышей проводили согласно экспериментальному подходу, представленному в работах [Kim T.Y. et al., 1990; Yee G,K. et al., 1990], с незначительными модификациями (схема 7). Мышей линии СВА (самцы весом 18-20 г., возраст 8-10 недель) сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне. Через 144 ч после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного уха наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2% раствора в ацетоне). На поверхность другого уха наносили 5 мкл растворителя (ацетона) в качестве контроля. Через последующие 24 часа оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека опытного (аппликация

ДНФБ) и контрольного (аппликация ацетона) ушей. Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле:

% супрессии = ( 1 - (Е - К")/(К+- К"))-100%, где Е, К+ и К" - отек уха у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля, соответственно.

Схема 7. Влияние предоблученного МЦ540 на реакцию контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ. (Схема эксперимента). сенсибилизация - ФБР (положительный контроль)

- МЦ540 без облучения

- облученный МЦ540 50 мкл 0,3% ДНФБ +в/в0,5мл накожно ,

\\ или:

\ 24 ч )^2^>?~&-^1 * регистРа1*ия

^^^f^- отека уха 5 мкл 0,2% ДНФБ накожно

Раствор МЦ540 в ФБР (1,76-10'5 М, с 0,5%" этанола) облучали разными дозами видимого света зеленого диапазона (к = 546 нм, I = 23,6 Вт/м2). Процесс фотолиза М1Д540 контролировали спектрофотометры чески. Облученный разными дозами раствор МЦ540 вводили внутривенно по 0,5 мл мышам через 120 часов после сенсибилизации последних ДНФБ, т.е. за 24 часа до повторного нанесения гаптена (Схема 7). В группе положительного контроля (К+) сенсибилизированным ДНФБ мышам вводили по 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5%> этанола вместо исследуемого соединения МЦ540. В качестве отрицательного контроля (К') служила группа интактных (несенсибилизированных ДНФБ) мышей, получивших аппликацию разрешающей дозы ДНФБ (5мкл 0,2 % раствора в ацетоне).

Результаты экспериментов представлены на рис. 21 (А, Б).

Из рисунка 21 А видно, что МЦ540 без облучения не влияет на КЧ. Напротив, предоблученный МЦ540 обладает супрессорным действием на КЧ. Видно так же, что интенсивность супрессии КЧ определяется временем предоблучения МЦ540: чем больше доза облучения, т.е. чем больше глубина фотолиза (на это указывает уменьшение оптической плотности спектров поглощения МЦ540 с увеличением дозы облучения (рис.21,Б)), тем сильнее супрессия реакции КЧ (рис.21,А).

Полученные данные указывают, на то что увеличение дозы облучения МЦ540 приводило к росту (накоплению) количества фотопродуктов МЦ540, обладающих супрессорным действием па КЧ.

Возникает вопрос: существует ли корреляция между дозой облучения МЦ540 и количеством накопленных фотопродукгов с супрессорной активностью? Для ответа на данный вопрос были проведены следующие эксперименты. Мыши были разделены на серии А и Б (рис. 22). В серии А (рис. 22, кривая 2), мышам внутривенно вводили по 500 мкл раствора МЦ540, предоблученного в течение разного времени, а именно: 0, 28, 56, 84, 112 и 140 минут. На мышах серии Б (рис. 22, кривая 1) дозовую зависимость влияния МЦ540 на КЧ моделировали различными вводимыми объемами МЦ540, облученного в максимальной дозе. Мышам вводили по 500, 400, 300, 200 и 100 мкл МЦ540, облученного в течение 140 мин. Вводимые объемы серии опытов Б были эквивалентны (кратны) дозам облучения в серии опытов А, т.е. 140, 112, 84, 56 и 28 мин. соответственно.

На рис. 22 видно, что интенсивность супрессии КЧ зависит как от дозы облучения (кривая 2), так и объема введенного предоблученного МЦ540 (кривая 1). При этом следует отметить, что чем больше объем введенного предоблученного МЦ540, тем сильнее супрессия КЧ. Видно также, что кривые 1 и 2 достоверно неразличимы, что указывает на корреляцию между дозой облучения и количеством фотопродуктов МЦ540 с супрессорными свойствами.

Рис. 22 Соотношение интенсивности сунрсссорного действии МЦ540 при его нредоблученип разными дозами (2) и введении разных объемов (1).

Кривая 1: МЦ540 (1,76-10° М в ФБР, содержащем 0,5% этанола)

облучали (X = 546 нм, I = 23,6 Вт/м2) в течение 140 мин при 7°С.

Мышам вводили в/в разные объемы (100, 200, 300, 400, 500мкл)

облученного МЦ540 через 120 ч после сенсибилизации ДНФБ.

fc Кривая 2: МЦ540 (1,76-10° М в ФБР, содержащем 0,5% этанола)

облучали (X = 546 нм, 1 = 23,6 Вт/м") в течение разного времени (28. 56, 84, 112, 140. мин) при 7"С. Мышам вводили в/в по 500 мкл пМЦ540 через 120 ч после сенсибилизации ДНФБ. К+ и К ~ положительный и отрицательный контроли, соответственно.

Полученные нами результаты не позволяют сделать вывода о химической структуре фотопродуктов МЦ540, приводящих к супрессии КЧ. Однако известно, что при фотолизе МЦ540 в водных растворах и в этаноле образуются такие фотопродукты, как С| (меродантоин), С2 и С5 (химические структуры приведены на рис.2 Б раздела "Обзор литературы") [Pervaiz S., et al., 1998; Pervaiz S.,et al., 1999]. Можно предположить, что эти фотопродукты могли вносить вклад, или могли быть ответственными за супрессорное действие на КЧ.

Известно, что реакция контактной чувствительности на разные гаптены

"I может быть опосредована разным типом иммунокомпетентных клеток

[Watanabe Н. et al., 2002; Park В.К. et al., 1998; Nakamura N. et al., 2003].

Например, в большинстве работ показано, что клетками, которые опосредуют развитие контактной чувствительности на ДНФБ и оксазолон являются CD8+ Tel лимфоциты [Nakamura N. et al., 2003, Wang В. et al.. 2001]. Однако в некоторых публикациях считается, что для ДНФБ и оксазолона эффекторными клетками могут быть Т-лимфоциты фенотипа CD4+ Thl [Wang В. et al., 2001; Wang В. et al., 2000; Park В.К. et al., 1998]. При изучении эффектов предоблученного МЦ540 на реакцию контактной чувствительности для инициации КЧ мы использовали только один гаптеи - ДНФБ. Осталось неясным, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на реакцию КЧ к другому виду гаптена, например, к оксазолону. Поэтому на следующем этапе мы оценили действие фотопродуктов МЦ540 на КЧ к оксазолону.

Мышей сенсибилизировали путем аппликации на брюшко 50 мкл 2% раствора оксазолона в ацетоне. Через 6 сут. (144 ч) после сенсибилизации па внутреннюю поверхность одно ухо наносили 5 мкл 0,4% раствора оксазолона в ацетоне. На поверхность другого уха наносили 5 мкл растворителя (ацетона) в качестве контроля. Через 24 ч измеряли отек опытною (аппликация оксазолона) и контрольного (аппликация ацетона) уха. В экспериментальных группах мышам, сенсибилизированы оксазолоном, вводили внутривенно по 0,5 мл необлученного или облученного в течение двух часов (1=23,6 Вт/м2, А=546 нм) раствора МЦ540 (1,76-10"5 М в ФБР, содержащем 0,5% этанола). Введение растворов проводили через 120 часов после сенсибилизации оксазолоном. В группе, положительного контроля (К+) сенсибилизированным оксазолоном мышам вводили по 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5% этанола, вместо исследуемого образца МЦ540. В качестве отрицательного контроля (К' ) служила группа интактных (несенсибилизированных оксазолоном) мышей, получивших аппликацию на ухо разрешающей дозы оксазолона (5 мкл 0,4 % раствора в ацетоне).

Результаты данных экспериментов приведены на рис. 23, из которого видно, что необлученный МЦ540 (0 ч.) достоверно не влиял на реакцию КЧ к оксазолону (р>0,05 по сравнению с К+). Напротив, облученный в течение 2 ч МЦ540 полностью, до уровня отрицательного контроля ингибировал КЧ к оксазолону (р

Таким образом, обнаружено, супрессорным действием на реакцию или оксазолона), использованного для что фотопродукты МЦ540 обладают КЧ независимо от вида гаптена (ДНФБ инициации данной реакции.

~ 0.3

S 0.2

К"

к+

время облучения МС540 (ч)

Рис. 23. Супрессия КЧ к оксазолону у мышей под действием предоблученного МЦ540.